【摘要】 目的: 研究 Na+通道阻滞剂河豚毒素(TTX)停搏液对离体大鼠心肌粘合连接的 影响 . 方法 : Wistar大鼠20只随机均分为TTX组和STH2（St. Thomas2)组，建立离体心脏Langendorff和Neely灌注模型，待搏动稳定，灌注30 min后停搏60 min，再灌注60 min，观察各组心脏停搏前后心率（HR）、冠状动脉流量(CAF)、左心室收缩末期压力(LVESP)以及压力变化速率(±dp/dt)的恢复率. 采用免疫组化和Western Blot检测大鼠心肌α肌动蛋白（αactin）的分布和量的变化；免疫组化检测N型钙粘蛋白（Ncadherin）的分布及量的变化. 结果: TTX组和STH2组的停搏时间分别为（8.55±0.68） s和（9.49±0.49） s；复搏时间分别为（10.12±0.66） s和（10.88±0.61） s，与STH2组比较，TTX组的停搏时间和复搏时间均明显缩短 (P<0.01或P<0.05). 复搏后，TTX组和STH2组的HR， CAF， LVESP， +dp/dt及-dp/dt的恢复率分别为（85.65±1.98）%，（91.81±2.29）%，（85.03±0.91）%，（93.59±2.22）%，（92.87±2.59）%和（77.66±1.56）%，（88.28±1.81）%，（82.24±0.82）%，（90.25±3.31）%，（88.36±4.65）%，TTX组的各项血流动力学参数恢复率均优于STH2组(P<0.01，P<0.05). 免疫组化显示TTX组和STH2组的N型钙粘蛋白和α肌动蛋白的表达量分别为0.06765±0.00027，0.07375±0.00049和0.02426±0.00025，0.03047±0.00017. Western Blot显示TTX组和STH2组的α肌动蛋白的表达量分别为864.8±6.5，347.0±7.5. 与TTX组比较，STH2组分布紊乱，量明显减少(P<0.01). 结论: 以TTX 阻断Na+通道为特点的心脏停搏液对大鼠心肌缺血再灌注损伤时的粘合连接及心功能的保护作用优于STH2心脏停搏液.

【关键词】 TTX停搏液；河豚毒素；钙粘着糖蛋白类；肌动蛋白类；粘合连接

　　0引言

　　粘合连接是由钙粘蛋白通过纽蛋白和α辅肌动蛋白与胞质内肌动蛋白丝相连构成，是心肌细胞间最重要的连接结构之一［1］. 已有的研究［2-3］证实了以阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)阻断Na+通道为特点的心脏停搏液对心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury， MIRI）显示出一定的优势，有关的研究主要集中在对细胞器等方面，而对细胞粘合连接的研究还少见报道. 本实验旨在观察以TTX阻断Na+通道为特点的心脏停搏液在MIRI中对粘合连接的影响，同时监测心功能的变化，以探讨其可能的机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料成年Wistar大鼠20只，雌雄不拘，体质量200～250 g（第三军医大学大坪 医院 实验动物中心）；TTX（泰州康特生物工程公司）；N型钙粘蛋白（Ncadherin）一抗，α肌动蛋白（αactin）一抗，生物素标记的二抗及免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDSPage凝胶配制试剂盒，彩色预染蛋白分子量标准，PVDF膜（江苏碧云天公司）；ML870B2 Langendorff离体心脏灌流系统（澳大利亚ADInstruments公司）. KrebsHenselEit液（KH 液) (mmol/L) 成分：NaCl 119，NaHCO3 25，KCl 4.75，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.18，CaCl2 1.4，Glucose 11，42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合，维持pH 7.8（自行配制）；TTX心脏停搏液：质量浓度为20 μmol/L的TTX加入KH液中；STH2心脏停搏液成分(mmol/L)：NaCl 110.0，KCl 16.0，MgCl2 16.0，CaCl2 2.0，Glucose 11.0,维持pH 7.8（自行配制）.

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组将20只大鼠随机分为TTX组和STH2（St. Thomas2)组，每组大鼠10只. TTX组采用TTX心脏停搏液停搏；STH2组采用STH2心脏停搏液停搏.

　　1.2.2实验模型的建立大鼠腹腔注射肝素盐水200 IU，20 min后脱颈处死，迅速取出心脏，建立离体鼠心Langendorff和Neely灌注模型. 用37℃, 42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合的KH液经主动脉根部逆行灌注，压力60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，稳定15 min. 左心房插管，左心室置入测压管，灌注液转流，转为工作心脏灌注模型，灌注压15 mmHg，后负荷52～60 mmHg，稳定5 min，测定心率（heart rate，HR）、冠状动脉流量（coronary artery flow, CAF）、左心室收缩末期压（left ventricular end systolic pressure， LVESP）、左心室最大压力变化速率（maximal rise in left ventricular pressure/maximal fall in left ventricular pressure，±dp/dt. 工作15 min后，主动脉根部按2 mL/100 g质量注入4℃心脏停搏液使心脏停搏，并观察心脏停搏时间. 停搏30 min后再经主动脉根部按2 mL/100 g质量注入心脏停搏液停搏，停搏过程中同时给予4℃盐水纱布冷敷. 停搏60 min后给予37℃, 42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合的KH液经主动脉根部逆行复灌，观察心脏复搏时间. 15 min后转为工作心脏灌注模型，共复灌60 min，并在工作心灌注稳定后40 min测定血流动力学参数，血流动力学参数的恢复率用复搏后的参数除以停跳前的相应参数. 20 min后停止实验，取部分左心室肌50 mg，-80℃保存，用于心肌Ncadherin和αactin的检测.

　　1.2.3心肌Ncadherin和αactin的免疫组化检测取3 mm×3 mm×3 mm大小心肌组织行石蜡切片，SABC法行免疫组化染色，光学显微镜观察心肌Ncadherin和αactin的分布情况并采集图像，采用imagepro plus 6.0图像 分析 系统进行半定量检测，用平均吸光度A值表示Ncadherin和αactin的相对含量.

　　1.2.4心肌αactin的Western Blot检测取50 mg心肌组织，提取总蛋白，BCA法定量，蛋白电泳分离、转膜、抗原抗体反应及ECL显色，采用quantity one图像分析系统采集图像并行半定量分析.