【摘要】 目的： 观察过氧亚硝基阴离子（ONOO-）对谷氨酸脱氢酶（GDH）的硝基化修饰及功能调控. 方法 ： GDH与ONOO-体外反应，测定酶活性及别构调节效应，Western Blot检测GDH硝基化修饰；制备含“去硝基化酶”的脾脏蛋白，观察能否逆转ONOO-作用. 结果： 4~12 μmol/L ONOO-不 影响 GDH活性和二磷酸腺苷(ADP)别构激活作用，但使三磷酸鸟苷（GTP， 10 μmol/L）别构抑制作用由（49±4）%降低至（69±7）%和（75±3）%；36~108 μmol/L ONOO-使GDH活性由（0.81±0.05） kat/kg降低至（0.55±0.06）和（0.29±0.07） kat/kg，使GTP（10 μmol/L）别构抑制作用降低至（83±4）%和（95±7）%；324 μmol/L ONOO-使GDH完全失活. Western Blot检测到ONOO-使GDH发生硝基化修饰．脾脏蛋白可部分逆转上述作用. 结论： ONOO-可通过硝基化修饰调控GDH催化功能.

【关键词】 谷氨酸脱氢酶；过氧亚硝酸；酪氨酸硝基化修饰；别构调节

　　0引言

　　谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）催化L谷氨酸与α酮戊二酸相互转化，是联系氨基酸和糖代谢的枢纽. GDH在细胞内可能会发生酪氨酸硝基化修饰［1］，但该修饰对酶催化功能的影响尚少见报道. 鉴于体内蛋白硝基化主要通过过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)介导［2］，同时GDH催化功能被别构激活剂二磷酸腺苷(adenosine 5′diphosphate, ADP)和抑制剂三磷酸鸟苷（guanosine 5′triphosphate, GTP）调节［3］，本 研究 观察ONOO-对GDH催化活性和别构调节的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料牛肝脏GDH纯酶（Type I, ammonium sulfate suspension, ≥40 units/mg protEin），还原型辅酶I（βNADH），α酮戊二酸，脂多糖(from Escherichia coli 055:B5) (美国Sigma公司)；抗硝基化蛋白mAb(antinitrotyrosine, antiNT，美国Cayman Chemical公司)；硫酸铵，ADP，GTP(美国Amresco公司)；SmartSpec 3000型分光光度计(美国Biorad公司).

　　1.2方法

　　1.2.1ONOO-合成与定量硝酸化的双氧水与亚硝酸钠，以三通管迅速推入氢氧化钠溶液，得黄色产物，以消光系数1.670 (mmol/L)-1 ·cm-1定量［4］.

　　1.2.2GDH与ONOO-反应GDH透析除去硫酸铵，蛋白浓度调整为0.2 mg/mL，取300 μL置于1.5 mL离心管，另取1 μL ONOO-置于离心管内壁，使反应体系中ONOO-的终浓度为0，4，12，36，108和324 μmol/L，快速震荡10 s，加入300 μL缓冲液终止反应，立即进行酶活性测定和硝基化修饰检测.

　　1.2.3GDH催化活性测定按照 参考 文献 ［5］的方法进行测定，反应体系为250 μL，包含50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4), 50 mmol/L硫酸铵, 160 μmol/L βNADH, 5 mmol/L α酮戊二酸和5 μL GDH酶溶液；记录3 min内340 nm吸光度改变量. 以βNADH的消光系数6.22 (mmol/L)-1·cm-1 计算 底物消耗速率，由公式［(△A 340 nm/min)/6.22］×250 μL×10-3÷0.5 μg计算每1 μg GDH每分钟转换底物的速度，每分钟转换1 μmol底物定义为1单位，将单位值折算为比催化活性kat/kg.

　　1.2.4GDH别构调节效应测定为测定ADP的别构激活效应，在反应体系中加入新鲜配置的ADP，使其终浓度为300 μmol/L，并以氢氧化钠调整pH 8.0, 然后测定GDH催化活性；为测定GTP的别构抑制效应，在反应体系中加入10 μmol/L GTP，然后测定GDH催化活性［5］.

　　1.2.5Western Blot检测GDH硝基化修饰ONOO-处理后的GDH立即进行SDSPAGE分离，每泳道上样量为50 ng；其中一块凝胶用于银染以确保上样量一致，另一块凝胶进行湿法转膜，硝酸膜用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h后，与antiNT（1∶5000）反应过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）进行检测.

　　1.2.6脾脏蛋白对GDH修饰的影响按照参考文献［6］的方法制备脾脏蛋白，雄性SD大鼠，腹腔注射脂多糖20 mg/kg，24 h后，取脾脏，以TrisHCl(pH 7.4)匀浆，105 000 g离心，1 h，保留上清得脾脏蛋白，其中含有较高浓度的“去硝基化酶”［6］. ONOO-处理后的GDH,蛋白浓度调整为0.01 mg/mL，与等体积的脾脏蛋白（6 mg/mL）室温反应2 h，取 50 μL与等体积的2×电泳上样缓冲液混合，每泳道上样20 μL，进行Western Blot 检测硝基化修饰的改变，同时取50 μL检测催化活性. 作为对照，将脾脏蛋白煮沸5 min，以灭活“去硝基化酶”，进行平行实验. 以上实验均重复6次.

　　统计学处理：计量数据以x±s表示，以SPSS13.0软件包进行方差 分析 (ANOVA)，多重比较采用StudentNewmanKeuls检验法.