作者：王斌生,曹农,柴琛,俞永江,武光

【摘要】 目的: 探讨蛋白激酶C(PKC)家族成员PKCα和PKCδ在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系. 方法 ： 胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠SAP模型，观察胰腺及肺脏病 理学 变化，采用免疫组织化学方法分别检测PKCα，PKCδ在SAP大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比 分析 . 采用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）检测96只大鼠胰腺组织中PKC mRNA的表达情况. 结果： 建模后1，6，12和24 h假手术（SO）组胰腺中PKCα表达分别为0.70±0.04，0.71±0.05，0.75±0.04和0.71±0.07；SAP组分别为0.83±0.05, 0.95±0.09, 1.10±0.10和1.08±0.16，两组各时间点之间差异均有统计学意义（P<0.01）. 轻型急性胰腺炎（MAP）组大鼠建模后胰腺中PKCα表达分别为0.73±0.04, 0.73±0.03, 0.85±0.08和0.84±0.06，与SO组各时间点相比，在12 h和24 h差异具有统计学意义（P<0.05），与PKCα相类似，PKCδ的表达在1 h开始增高，12 h达到高峰，且维持时间较长. MAP组PKCδ在12 h达到高峰，但维持时间较短，24 h时有所减低. 结论： PKCα在SAP的病程 发展 中起重要作用. 监测PKCα水平可为SAP的早期诊断提供帮助.

【关键词】 胰腺炎;信号传导;蛋白激酶C;逆转录聚合酶链反应

　　0引言

　　近年来,重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP)的 研究 多集中在炎症因子通过信号传导引发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) ,并渐进发展成为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrame, MODS)上，但对于SAP的早期诊断仍缺乏特异性指标. 已有研究［1-2］证实蛋白激酶C(protEin kinase C, PKC)可调控多种促炎因子（IL1,IL12,TNF和NFΚB等）的活化，测定血清IL12水平能预测SAP的预后，对其早期诊断具有重要意义［3］. 我们采用免疫组织化学法和RTPCR法测定PKC在SAP中的表达水平，以探讨PKC在SAP中的作用机制，为临床诊治SAP提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料清洁级SD大鼠96只（雌雄各半），体质量220～260 g，（甘肃省中医学院实验动物中心），实验前12 h禁食，自由饮水. 牛黄胆酸钠(美国Sigma公司)；一步法总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；一步法反转录聚合酶链式反应(RTPCR)试剂盒（大连宝生物公司）；即用型 SABC免疫组化染色试剂盒，兔抗 PKCα，鼠抗 PKCδ和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司).

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组96只SD大鼠随机分为假手术(sham operation，SO)组、轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组和SAP组，每组动物32只.

　　1.2.2模型制作MAP组大鼠术前禁食12 h，自由饮水,戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉,无菌条件下上腹正中切口进腹,于十二指肠内侧见片状分布的胰腺,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入导管,导管进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1 cm,用微量泵以0.1 mL/min速度推注20 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg,推注完毕后无损伤动脉夹夹闭胰胆管壶腹部观察10 min后拔管,去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹. SAP组用微量泵以0.1 mL/min速度推注50 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg, 其余步骤同MAP组. SO组开腹仅轻轻翻动胰腺，关腹后皮下注射40 mL/kg生理盐水.

　　1.2.3取材和评分各组动物在建模后于 1，6，12和24 h四个时间点，（各时间点8只动物）以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经原切口入腹，无菌条件下取胰腺和肺脏，分别保存于40 g/L甲醛及-80℃冰箱，按 文献 ［4］的方法，由病理医师对大鼠胰腺及肺脏组织在光镜下按水肿、出血、感染和坏死四方面的轻重程度进行盲法病理评分.

　　1.2.4免疫组织化学染色切片脱蜡至水，pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，室温下3 g/L H2O2孵育30 min，山羊血清封闭背景，加兔抗 PKCα多克隆抗体及鼠抗 PKCδ mAb（1∶50） 4℃过夜，滴加二抗 37℃孵育1 h，加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物，室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇脱水. 阴性对照以 PBS代替一抗.1.2.5RTPCR检测取组织100 mg匀浆后加入1 mL总RNA提取试剂，抽提组织总RNA，紫外分光光度仪测定标本RNA纯度，以甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照扩增 PKCα及 PKCδ. 所有引物均由上海生物工程公司合成，PKCα引物序列: 上游5′gggatgaaatgcgacacc 3′，下游 5′ctctgagacgccgaagga 3′, 退火温度 56℃，共循环30次，产物长度300 bp；PKCδ引物序列：上游5′ctgtggcactttgctctg 3′下游 5′ttctgggtcacttggttc 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度 153 bp；内参照 GAPDH引物序列：上游 5′tacagatcacgaaagcatagagga 3′下游 5′tccattcgttcctgaacagcgaca 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度411 bp；取RTPCR扩增产物4 μL,加上样缓冲液1 μL，在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为电压100 V, 60 min，凝胶图像分析系统分析，以目的基因与内参照GAPDH产物比值代表该样品PCR产物的相对含量.

　　统计学处理：采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析，各组计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.