【摘要】 目的 观察中医不同治法（补气、活血、化痰）对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）诱导细胞凋亡及Caspase-3和NF-κB表达的影响。方法 建立大鼠动脉粥样硬化在体心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI），免疫组化、ESMA法观察心肌细胞Caspase-3及NF-κB因子表达。结果 中医不同治法（补气、活血、化痰）均能降低AI；补气法、活血法能够抑制Caspase-3及NF-κB的表达，而化痰法对以上因子的表达无明显影响。结论 中医不同治法（补气、活血、化痰）可能通过不同途径抑制I/R心肌细胞发生凋亡，从而对I/R心肌具有保护作用。
　　
　　【关键词】 补气法； 活血法； 化痰法； 心肌缺血再灌注损伤； 细胞凋亡； Caspase-3; NF-κB
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　　心血管疾病常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是一种多因素参与的复杂病理生理过程，涉及到多个环节。但无论由哪种途径引起的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，最终均可导致心肌细胞结构的改变和破坏。为此，笔者在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）大鼠MIRI模型上，观察中医补气、活血、化痰不同治法对大鼠心肌缺血再灌注后心肌超微结构影响，并观察Caspase-3及NF-κB的表达，从分子水平探讨补气、活血、化痰不同中医治法拮抗MIRI细胞凋亡机理的异同，以期更加客观和直接地揭示中医不同治法的心肌保护效应，为进一步临床应用提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要药物与试剂
　　1.1.1 药物制备给药剂量和给药方式 保元汤、血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤水煎剂按照参考文献［1］制备；保元汤以成人等效量0.95 g生药/kg体重灌胃，血府逐瘀汤以成人等效量1.37 g生药/kg体重灌胃，瓜蒌薤白半夏汤以成人等效量0.59 g生药/kg体重灌胃，给药体积均按1 ml/100 g计算，于缺血再灌注前30 min给大鼠灌胃，缺血再灌注组注入等量生理盐水。
　　1.1.2 试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒、鼠抗Caspase-3单克隆抗体以购自美国sigma公司，NF-κB P65抗体(一抗)和Western blot luminol reagent购自美国satus cruzs公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)购自北京中山公司;T4多核苷酸激酶和NF-κB探针购自美国Promega公司；［r-32p］ATP购自北京亚辉公司。
　　1.2 动物模型制备及分组 健康雄性wistar大鼠50只，体重250～300 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。参照参考文献［2］的方法，制备高脂乳剂，按10 ml/kg灌胃，每日1次，连续12周，造成大鼠AS模型。随机分成5组，即假手术组（sham组）、IRI模型组(I/R组)、补气法组（BQ组）、活血法组（HX组）、化痰法组（HT组），每组10只动物。
　　在大鼠AS模型的基础上，手术建立大鼠MIRI模型：大鼠称重后氯胺酮80 mg/kg经腹腔注射麻醉。气管切开接呼吸机人工呼吸，记录Ⅱ导联心电图。开胸后以左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉。以心电图ST段明显抬高、结扎点远端心肌发绀为结扎成功标志。结扎冠状动脉左前降支30 min，复流3 h。sham组只穿线不结扎冠脉。
　　1.3 检测指标与方法
　　1.3.1 心肌凋亡细胞原位检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素平移末端标记技术-TUNEL法(TdT-mediated dUTP end labeling)标记凋亡心肌细胞。按试剂盒说明书进行。TUNEL阳性反应为核呈棕褐色或棕黄色颗粒。核呈TUNEL阳性反应且具备细胞凋亡的形态学特征者被判定为凋亡细胞。在每张玻片上随机取4个高倍视野(400×)，计数每个视野凋亡细胞总数，并计算凋亡指数(Apoptosis Index，AI)。
　　1.3.2 Caspase-3表达检测 二步法免疫组化法测定，参照试剂盒说明操作，1∶50稀释，兔二步法检测试剂盒(PV-6001)购自北京中杉公司，胞浆或胞核显示黄棕色颗粒为染色阳性。
　　1.3.3 NF-κB表达检测 凝胶电泳迁移率(EMSA)法定：称取各组心肌组织0.1 g经匀浆离心后取上清液，考马斯亮蓝G-250测核蛋白浓度，并调整核蛋白浓度为1 μg/μL,置于-70℃保存备用。用T4多核苷酸激酶和［r-32p］ATP对寡核苷酸NF-kB探针进行末端标记，与提取的核蛋白进行结合反应。反应液经7%非解离聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后放射自显影。用分析软件以积分光密度值表示电泳区带的结果。
　　1.4 统计学处理 数据用均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS 14.0 for windows统计软件进行数据分析，各组间比较采用方差分析（ANOVA），组间两两比较采用最小显著差值法（LSD），同一组治疗前、后比较采用配对t检验。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。
　　2 结果
　　2.1 心肌细胞凋亡 光镜下观察，Sham组偶见凋亡阳性细胞，I/R组有大量的心肌细胞凋亡，且积聚成团，AI显著高于sham组（P＜0.01）。BQ组、HX组及HT组心肌细胞凋亡数均较I/R组明显减少（P＜0.01）。见表1。
　　2.2 心肌细胞Caspase-3的表达指数 结果显示，Caspase-3的阳性表达在sham组与其他组比较有显著差异（P＜0.01）；与sham组比较，I/R组Caspase-3的阳性表达指数显著升高(P<0.01)。各治疗组中，BQ组、HX组作用最显著，能有效抑制Caspase-3的阳性表达，与I/R组比较，均有显著性差异(P<0.01)；与sham组比较，HT组虽也能降低Caspase-3的表达指数，但与I/R组比较无统计学意义(P＞0.05)。见表2。
　　2.3 心肌NF-κB的表达 结果显示，sham组心肌组织表达极低，呈阴性或弱阳性表达；I/R组与sham组比较，NF-κBP65活化显著上调(P<0.01)，呈强阳性表达。各治疗组中，BQ组、HX组作用最显著，能有效抑制NF-κBP65活化，与I/R组比较，均有显著性差异(P<0.01)；而HT组虽能抑制NF-κBP65活化，但与I/R组比较无统计学意义(P＞0.05)。见表3。
　　3 讨论
　　细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受伤细胞以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制。细胞凋亡功能的抑制将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常，而凋亡功能的亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关［3］。动物实验和临床研究发现，细胞凋亡可能是心肌缺血/再灌注损伤发病机制的重要环节之一。Gottlieb等［4］首先在兔心脏上发现再灌注损伤促进了细胞凋亡。Cao等［5］采用原位末端标记和琼脂糖凝胶电泳证实，缺血和缺血再灌注的大鼠有典型的凋亡形态学改变和DNA梯状电泳改变，即再灌注损伤可导致心肌细胞凋亡。有研究者证实，在动物心脏移植排斥反应中，移植3 d后出现大量凋亡的心肌细胞［6］。Caspase-3为天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，在细胞凋亡过程中起中心环节作用，故也被称为死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最后执行因子。Moolman等［7］研究发现，大鼠心脏灌流离体模型上，缺血预处理通过抑制Caspase-3的激活，减少缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡。NF-κB是一种具有基因转录多向调控作用的转录因子，参与心肌缺血再灌注损伤后的炎性反应、细胞凋亡与坏死。研究发现，在心肌缺血再灌注损伤大鼠模型中，缺血4 min后NF-κB蛋白即显著下降，缺血10 min后才开始逐渐恢复，而NF-κB活化相应从第5 rain开始持续增高，心肌再灌注则进一步放大缺血所致的NF-κB激活效应［8］。NF-κB的活化除引起炎性、免疫性的细胞因子表达外，还可产生一些抗炎和抗细胞凋亡的蛋白，如bcl-2家族、内源性抗氧化剂等［9］。