作者：曹媛,张献清，齐浩,曾成鸣

【摘要】 目的： 研究 γ射线辐照对β淀粉样肽(Aβ)诱导的红细胞膜损害的保护作用. 方法 ： 红细胞经50 Gy和100 Gy γ射线照射后，再用Aβ处理，分别用分光光度法测定红细胞溶血率和渗透脆性；扫描电镜观察细胞形态；1,6二苯基1,3,5己三烯（DPH）荧光探针标记检测细胞膜流动性. 结果： γ射线辐照可抑制红细胞的 自然 溶血和Aβ导致的溶血，但只有100 Gy辐照的差异具有统计学意义（P<0.05），使自然溶血率和Aβ引起的溶血率由（3.76±0.50）%，（11.90±1.50）%分别降至（1.87±0.09）%和（7.90±0.90）%. 50 Gy和100 Gy的辐照均可降低Aβ引起的细胞变形程度，增加细胞膜的流动性（P<0.05），荧光探针的各相异性值由0.36±0.01分别降至0.33±0.00和0.32±0.01，并提高红细胞对低渗溶液的耐受性，50%溶血时的NaCl浓度由82.3 mmol/L分别降至80.7 mmol/L和76.9 mmol/L. 结论： 在本实验条件下，γ射线辐照可降低Aβ对红细胞膜的损伤，并可增加红细胞膜的流动性及稳定性.

【关键词】 γ射线； 淀粉样β蛋白； 红细胞； 溶血； 膜流动性

　　0引言

　　低剂量γ射线辐照（<1 Gy）可刺激机体的免疫功能，提高机体的抗病能力［1］. 目前 ，临床上常用15~35 Gy的γ射线对血液进行辐照，灭活血液中的淋巴细胞，以预防输血相关的免疫疾病［2］. 该剂量范围的γ辐射对血液中的其他成分也可产生一定的 影响 ［3-4］. 红细胞在经400 Gy辐照后，短时间内可增加细胞的稳定性［5］. 本研究采用小于100 Gy的γ射线处理红细胞，以β淀粉样肽（βamyloid peptide, Aβ）诱导红细胞膜损害为实验模型，研究此剂量范围的辐射对红细胞某些性质的影响，以及对Aβ的细胞毒性的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料新鲜全血取自健康志愿者，枸醛酸抗凝；Aβ和荧光探针1,6二苯基1,3,5己三烯（diphenylhexatriene, DPH）（美国SigmaAldrich公司）；其它试剂均为国产 分析 纯. 1240型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司)；LS55型荧光分光光度计（美国PerkinElmer公司）；3k30型冷冻离心机（美国Sigma公司）；Gammacell R 1000型血液辐照仪 (加拿大Nordian公司)；Quanta 200型环境扫描电镜（荷兰PhilipsFEi公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1红细胞的制备和辐照处理取新鲜全血750 g，4℃离心10 min，吸去上层血浆和白细胞，并用等渗PBS（150 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4）洗涤3次,制备成200 mL/L细胞悬液，然后用γ射线照射，照射剂量分别为0，50和100 Gy.

　　1.2.2红细胞溶血率的检测照射过后的红细胞悬液用等渗PBS稀释至20 mL/L，加入Aβ使其终浓度为5 mg/L，37℃水浴30 min后取出，750 g，4℃离心10 min，取上清， 540 nm处测出吸光度值A1；沉积红细胞用蒸馏水全溶血后离心，用同样方法测得吸光度值A2. 按下式 计算 溶血率：溶血率（%） = A1/（A1+A2）× 100%.

　　1.2.3扫描电镜观察红细胞形态处理过的红细胞经终浓度为10 g/L戊二醛固定，用500，700，900，1000 mL/L丙酮系列脱水，喷金后进行扫描电镜观察.

　　1.2.4红细胞的渗透脆性测定红细胞分为未照射组，50 Gy照射组和100 Gy照射组. 配制不同渗透压的PBS，其中NaCl的浓度为0~135 mmol/L，在上述PBS中分别加入各组红细胞悬液，细胞终浓度为2 mL/L，37℃水浴30 min，取出后以1.3.2中的方法分别测溶血率，以NaCl浓度分别为135 mmol/L和0 mmol/L的PBS为对照和全溶血对照，计算50%溶血时的NaCl浓度.

　　1.2.5红细胞膜流动性的检测用四氢呋喃作溶剂配制2×10-3mol/L的DPH储存液,于棕色瓶中4℃低温保存. 工作液浓度为5×10-5mol/L,临用前用等渗PBS稀释. 红细胞用等渗PBS稀释至2 mL/L浓度，与DPH工作液等体积混合，于37℃水浴孵育45 min后，检测偏振荧光（激发光波长为362 nm，发射光波长为450 nm）.

　　统计学处理： 用SPSS10.0统计软件进行处理，实验数据以x±s表示，多个样本均数比较采用方差分析及t检验.

　　2结果

　　2.1红细胞的溶血率在未经辐照处理的情况下，等同实验操作可使红细胞发生少量溶血（溶血率<4%），而在红细胞经γ射线照射后，自然溶血率随着辐照增加而降低，在100 Gy时自然溶血率由（3.76±0.50）%降至（1.87±0.09）%，差异具有统计学意义（P<0.05）. 加入Aβ后可导致红细胞溶血率增高至（11.90±1.50）%（P<0.01），红细胞经γ射线照射后，Aβ导致的溶血作用降低，50 Gy照射组虽低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，而100 Gy辐照则使Aβ的溶血作用降低至（7.90±0.90）%，其差异具有统计学意义（P<0.05）.