作者：谢富华，吴小云，王润秀，熊亮，梁念慈

【摘要】 目的： 构建存活素（survivin）基因短发夹RNA(shRNA)的表达质粒，为乳腺癌RNAi介导的基因 治疗 打下基础. 方法 ： 设计并合成有小发夹结构的8条survivin shRNA对应模板序列，退火并与pShuttle 1.0CMV载体重组质粒；将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF7；MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度，流式细胞术检测细胞周期的变化，经Hoechst染色观察凋亡情况，RTPCR和Western Blot检测survivin基因的表达情况. 结果： 成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度；细胞受阻于G2/M期，并通过荧光染色发现有凋亡细胞；survivin基因表达受到抑制. 结论： 构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达，这为 研究 乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.

【关键词】 survivin； RNA干扰； shRNA

　　0引言

　　存活素（survivin）基因几乎表达于所有常见的人类肿瘤组织，尤见于乳腺癌和肺癌［1］. 有研究证明将小于30个核苷酸的小干扰RNA（small interferencing RNA, siRNA）或短发夹RNA(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中，同样能产生沉默效应. 目前 ，其载体构建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的［2-3］，但是用RNA polⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效［4］. 本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒，将其转染人乳腺癌MCF7细胞，初步探讨其诱导MCF7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的 影响 .

　　1材料和方法

　　1.1材料pShuttle 1.0CMV载体（产地ambion公司）；Lipofectamine 2000转染试剂盒(invitrogen)；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶（大连宝生物公司）；总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司)；逆转录聚合酶链反应( RTPCR)试剂盒（美国Qiagen公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1shRNA的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列： ① 5′GGACCACCGC ATCTCTACATTCAAGAAC3′, ②5′ACAGAGAAAG AGCCAAGAACAAA3′, ③5′AATTTGA GGAAACTGCGGAGA3′和一个错义序列5′TATGAGAATGGCAGCGA GATA3′（其碱基组成同序列③，但排列顺序不同），同源 分析 未见相同序列.

　　1.2.2重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计： 按pShuttle 1.0CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构：正义链：5′CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C3′，反义链：5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′. 重组质粒的构建：模板链合成并退火，将其定向克隆至穿梭载体pShuttle 1.0CMV中；转化DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单克隆，分别命名为pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol. 重组质粒的鉴定：提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.

　　1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF7用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50 mL/L CO2的培养箱中. 转染前24 h将约1×105个细胞接种至6孔板，转染时细胞融合度达30%～50%. 按Lipofectamine 2000操作手册进行转染：用质粒pShuttlesurvivin(13)以50 nmol/L的浓度分别转染细胞，设立阴性（加pShuttlecontrol）和空白对照组（加Lipofectamine 2000），每组设3个平行孔，培养24 h后行MTT检测，筛选出最有效的shRNA表达质粒，将最有效的质粒分别以5，10，50，100，150 nmol/L的终浓度转染MCF7细胞，每组设3个平行孔，设立对照组，培养24 h后再次行MTT检测［5］.

　　1.2.4流式细胞术检测接种MCF7细胞于60 mm平皿中（2×106/皿）. 接种后24 h，以最有效质粒的最佳浓度转染细胞，设阴性和空白对照组. 转染后48 h收集细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗1次，离心去PBS，加入预冷的700 mL/L的乙醇，4℃固定16 h以上. 离心去乙醇，PBS清洗1次，加0.5 mL 50 mg/L PI（含100 mg/L RNase A）于避光处染色30 min，用Coulter EPTCSXL31240流式细胞仪进行检测.

　　1.2.5Hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750 mL/L乙醇中浸泡24 h以上，风干，将盖玻片置于六孔板内，种入MCF7细胞培养过夜. 加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基，作用24 h，设阴性和空白对照组. 吸尽培养液，加入0.5 mL固定液，4℃固定过夜. 去固定液，用PBS洗两遍，每次3 min，吸尽液体. 加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，摇床上染色5 min. 用PBS洗两遍，每次3 min. 加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜检测.

　　1.2.6RTPCR检测按一步法RTPCR试剂盒说明书提取RNA后行PCR. survivin基因引物（产物为166 bp）P1：5′cagatttgaatcgcgggaccc3′，P2：5′ccaagtctggctcgt tctcag3′；GAPDH 引物（产物为280 bp）P1：5′gtagaggcag ggatgatgttc3′，P2：5′gagttag ctcactcattaggc3′. 反应条件：50℃反转录30 min；95℃初始PCR激活反应15 min；94℃变性0.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min；共35个循环；72℃反应延伸10 min. 取PCR产物3 μL于10 g/L琼脂糖凝胶电泳.

　　1.2.7Western Blot检测细胞转染后48 h提取总蛋白，经Bradford法测定蛋白浓度，设立空白和阴性对照. 每组分别取20 μg用以检测内参βactin蛋白质，取60 μg以检测Survivin蛋白，蛋白经100 g/L SDSPAGE电泳，100 V电转1 h，100 g/L脱脂奶封闭过夜. 在装有抗Survivin抗体和PVDF膜的袋中室温下摇动2 h，洗膜后加入二抗，室温下摇动1 h. 增强化学发光显色曝光.

　　统计学处理：采用SAS8.0软件包进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义.