【摘要】 目的： 研究 紧密连接蛋白occludin，ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达. 方法 ： 成年健康杂色豚鼠，耳廓反射灵敏，分别取耳蜗、脑、肺三组组织，免疫组织化学法及Western Blot研究紧密连接蛋白occludin，ZO1在耳蜗外侧壁血管纹中的表达，以脑组、肺组为阳性对照. 结果： 光镜下可见豚鼠耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞等边缘细胞中均强阳性颗粒表达，脑组、肺组毛细血管内皮细胞内壁也均有明显阳性表达；Western Blot下occludin, ZO1在耳蜗组中高表达，并且明显高于脑组与肺组. 结论： occludin，ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接中的高浓度表达，与维持血迷路屏障结构、功能密切相关.

【关键词】 occludin蛋白；ZO1蛋白；连接蛋白类；耳蜗；血迷路屏障

0引言

血迷路屏障（blood labyrinth barrier, BLB）的存在保证了内耳微环境的相对稳定，维持正常的内耳生理功能. 它主要由耳蜗外侧壁血管纹、螺旋韧带处连续无窗的毛细血管内皮细胞形成［1］. 血管纹是构成膜性蜗管外壁的重要组成部分，由毛细血管及边缘细胞、中间细胞、基底细胞构成. 毛细血管基膜菲薄，血管内皮细胞之间，边缘细胞之间和基底细胞之间均为紧密连接（tight junction, TJs）. TJs中最重要的是跨膜蛋白occludin与胞质附着蛋白ZO家族（zonula occludens protEin）及细胞内与其相连的细胞骨架蛋白. occludin及ZO1的表达和分布与内皮细胞通透性密切相关. 但TJs蛋白在内耳血管纹中的研究鲜见报道，本研究对occludin及ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹的表达和分布进行初步研究，为进一步从分子角度研究血迷路屏障TJs作一铺垫.

1材料和方法

1.1材料健康成年杂色豚鼠30只，雌雄不限，耳廓反射灵敏，体质量250～350 g，由第四军医大学实验动物中心提供.

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色动物10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，新鲜配置的40 g/L多聚甲醛灌注后断头，取出双耳听泡，刺开蜗尖及圆窗膜，灌注蜗尖数次，将耳蜗取出置入40 g/L多聚甲醛中，4℃中放置24 h后100 g/L EDTA脱钙14 d，同时取脑皮质及肺组织投入40 g/L多聚甲醛中24 h后700 mL/L乙醇室温保存. 石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片, 切片厚度5 μm，取三种组织的三套石蜡切片分别进行antiZO1，antioccludin和阴性对照染色切片，脱蜡、水化，PBS洗后分别加入一抗（Zymed Laboratories，美国），包括ZO1兔多克隆抗体（1∶100）及occludin兔多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；PBS洗；滴加羊抗兔二抗（Sigma，美国，1∶200），37℃孵育2 h；滴加链霉素卵白素过氧化物酶（ABC），37℃孵育1 h，PBS冲洗；DAB显色，自来水冲洗，脱水，透明，封片，在光镜下观察. 阴性对照实验采用PBS代替一抗，其余步骤同上.

1.2.2Western Blot检测动物10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后迅速断头，取出双耳听泡，在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹，同时取出脑皮质及肺，Western Blot检测前这些组织均保存于-80℃冰箱. 实验分三组，耳蜗组，脑组和肺组. 蛋白质的提取：将三组蛋白分别匀浆，匀浆器中加入组织裂解液,包括20 mmol/L Tris, pH 7.4, NaCl, NaF,焦磷酸钠，蔗糖，complete, Mini, EDTAfree药片（Roche Diagnostics，德国），冰上充分匀浆，12 000 g，4℃，离心5 min，收集上清. 考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量. 按照每泳道5 μg加载于SDSPAGE凝胶电泳孔中，以恒压120 V/40 mA电泳至溴酚蓝到达凝胶底边. 恒流300 mA转印于NC膜上. 丽春红染色，TBST缓冲液配置的50 g/L脱脂奶粉室温下封闭2 h. 三组分别加入兔抗豚鼠ZO1一抗（1 μg/mL），兔抗豚鼠occludin一抗（2 mg/L, Zymed Laboratories，美国）及兔抗actin（Santa Cruz,美国，1∶200），4℃过夜，TBST缓冲液洗膜2次，每次10 min，TBS缓冲液洗膜1次，10 min，加入HRP标记的二抗（北京中衫,1∶5000）,37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ECL化学发光系统（pierce）检测occludin，ZO1及βactin的蛋白表达水平. 分析 阳性条带的分子量大小，用TANON高清晰度 计算 机图像分析系统进行灰度扫描分析，根据信号的强弱分析蛋白的表达量. 以目的条带与βactin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平.

统计学处理：数据均用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件， 应用 Oneway ANOVA方差分析法对两组以上的数据进行两两之间进行统计学检验.

2结果

2.1Occludin,ZO1在耳蜗外侧壁血管纹、脑皮质及肺组织中的免疫组织化学染色光学显微镜下，耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、血管纹边缘细胞、基底细胞深染棕黄色阳性颗粒（图1A,2A），用PBS代替一抗时所有耳蜗细胞均未发现免疫信号（图1B，2B）；脑组中可见沿毛细血管内壁一周强阳性染色，在大血管中更为明显（图1C，2C）；肺组中（图1D，2D）见整张切片较强的阳性颗粒，主要表达在肺毛细血管内皮细胞.A：耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、边缘细胞、基底细胞occludin阳性染色，B：为阴性对照；C：脑组中毛细血管内皮细胞occludin阳性染色；D：肺组中毛细血管内皮细胞occludin阳性染色.

图1occludin分别在耳蜗组、脑组和肺组中的免疫组织化学染色SABC ×400

A：耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、边缘细胞、基底细胞ZO1阳性染色；B：阴性对照；C：脑组中毛细血管内皮细胞ZO1阳性染色；D：肺组中毛细血管内皮细胞ZO1阳性染色.

图2ZO1分别在耳蜗组、脑组和肺组中的免疫组织化学染色SABC ×400

2.2Western Blot结果采用occludin和ZO1的抗体可分别识别出三种组织上这两种蛋白的表达，采用βactin作为内参，分别于Mr 220 000，60 000，43 000出现阳性条带. 计算机灰度扫描软件分析灰度值（图3）.

3讨论

正常耳蜗微血管内皮细胞通透性对保证BLB微环境的稳态具有决定性的意义. 耳蜗微血管内皮细胞在形态及结构上具有其特殊性：①具有大量的紧密连接；②大部分毛细血管内皮细胞为连续的无窗型内皮；③胞质内胞饮小泡少. 以上几点提示耳蜗微血管内皮细胞对于物质的通透具有选择性，维持内、外淋巴液的正常循环.