作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉

【摘要】 目的：构建并制备血管生成素1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体. 方法 ：采用基因克隆技术克隆目的基因ANG1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrackCMV；使用Padeasy1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入QBI293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果：ANG1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带，证明pAdTrackCMVANG1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与pAdeasy1质粒重组后，产物经Pac I酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒pAdANG1EGFP构建成功；线性化重组的腺病毒转染入QBI293A细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./L，EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论：成功制备了pAdANG1EGFP腺病毒. 为骨组织工程血管化的 研究 打下基础.

【关键词】 血管生成素； 腺病毒； 基因转染； 增强型绿色荧光蛋白

0引言

大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因. 因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要. 血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而ANG1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］. 所以对于ANG1的研究对于大段骨缺损的 治疗 显得极有意义. 本研究中， 我们设计、 构建了携带ANG1基因的腺病毒（adenovirus）， 为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.

1材料和方法

1.1材料pcDNA3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒pAdTrackCMV(含EGFP基因)、pAdeasy1, 菌种BJ5183购自Stratagene公司；293A细胞株、转染试剂(lipofectamine 2000)购自Invitrogen公司. 各种限制性内切酶，T4连接酶、反转录酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, DNA聚合酶（PrimeSTARTM HS DNA polymerase）, PMD18T vector购自Takara公司. 质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（OMEGA BIOTEK）公司,mRNA提取试剂（PolyAtract system 1000）,MMLV购自Promega公司.

1.2方法

1.2.1血管生成素1 （ANG1）基因的克隆及鉴定①在Genebank上查询ANG1的序列为NM_001146. 根据此序列设计引物. 引物序列为：F: CCGCTCGAG ATGACAGTTTTCCTTTCC, R: TTTGATATCTCAAAAATCTAAAGGTCG上游引物引入XhoⅠ位点，下游引物引入EcoRⅤ位点. ②RNA的提取及cDNA的获得：使用PolyAtract system 1000试剂盒从胎盘组织中提取mRNA提取步骤按照说明书进行，将提取的mRNA使用反转录酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录为cDNA，步骤按照说明书进行. ③PCR扩增ANG1 基因片段：以上述获得的cDNA为模板，进行PCR反应. 反应条件为98℃ 10 s, 65℃ 5 s, 72℃ 2.5 min. 35个循环. 琼脂糖电泳鉴定. ④ANG1克隆入PMD18T vector，DNA测序鉴定：将PCR产物进行凝胶回收纯化后，克隆至PMD18T vector中，将质粒PMD18TANG1转化至细菌DH5α中，扩增后送公司测序.

1.2.2携带ANG1基因和报告基因EGFP 的腺病毒载体的构建①将基因ANG1克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV：质粒PMD18TANG1和穿梭载体pAdTrackCMV（含有基因EGFP）分别进行XhoⅠ/EcoRⅤ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，加入T4连接酶进行连接. 转化入细菌DH5α，提取克隆进行酶切鉴定. ②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒pAdeasy1转化入细菌BJ5183中，得到含有pAdeasy1的BJ5183细菌，将鉴定正确的携带目的基因ANG1的穿梭载体转化入含有pAdeasy1的 BJ5183中进行同源重组. 挑取其中较小的菌落扩增、提取质粒. ③重组病毒的鉴定：将重组的质粒Pac I酶切后进行8 g/L琼脂糖电泳，与标准的重组腺病毒酶切谱形进行对比，鉴定得到的重组病毒是否正确.

1.2.3重组腺病毒的包装及扩增①腺病毒的包装：培养293A细胞，6孔板按每孔4×105铺细胞，第2 d将重组的腺病毒质粒Pac I酶切线性化，并胶回收法纯化. 然后将线性化的质粒DNA使用脂质体lipofectamine 2000转染入293A细胞中. 第4 d换液，第11 d收集细胞，反复冻融收集病毒. ②腺病毒的扩增：得到病毒的1/3用于感染新的293A细胞，48 h收集细胞. 如此反复共进行4轮扩增，收集所有细胞，反复冻融，得到重组腺病毒.